Fast Super EvaGreen ® qPCR Master Mix

描述

产品名称：Fast Super EvaGreen ® qPCR Master Mix
产品货号：S2008
产品规格：100T，500T
产品内容

组分 A 包含 Super EvaGreen ® dye，dNTP，PCR buffer（含Tris 和 MgCl 2 ），热启动 Taq 聚合酶；组分 B 是 10 ×ROX 参照物。

产品参数
λabs/λem = 500/530 nm (结合 DNA)
λabs = 471 nm (未结合 DNA)
储存条件
本产品-20℃避光保存，推荐条件下至少可以储存 6 个月以上。使用前，将产品室温下解冻，并轻轻涡旋混匀，解冻后所有实验应在冰上操作。使用后，该产品可以重新冷冻储存。
产品介绍
Fast Super EvaGreen ® qPCR Master Mix 是一款用于实时定量 PCR 的即用型试剂盒。其中 Super EvaGreen ® 是一种新型的专门为 qPCR 和高分辨率溶解曲线分析设计的 DNA结合染料，它通过一种“按需求释放”的机制，极大地降低了对 PCR 扩增的抑制性。
Fast Super EvaGreen ® qPCR Master Mix 包含一种化学修饰的热启动 Taq DNA 多聚酶。这种 Taq 酶 2 min 内可以被完全激活，尤其适用于快速 PCR 反应。此外，这种 Taq DNA 多聚酶在室温下没有活性，不会对 DNA 造成污染，性能远远优于市面上抗体修饰的热启动酶。
Super EvaGreen ® 的另一个优点是它的安全性。常规的DNA 结合染料存在潜在的致突变性。基于这方面考虑，我们研发设计了 Super EvaGreen ® 染料，它不能透过细胞膜，因而不能与活细胞的基因组 DNA 结合，确保了其安全性。然而，其他所有的商业性 PCR 荧光染料都可以在几分钟内进入细胞，例如 SYBR Green I，是一种众所周知的环境毒性比溴化乙锭（EB）还要大的诱变剂。
此外，我们公司的 Super EvaGreen ® Master Mix 还有一个性能也十分卓越，即它的 PCR 产物可以直接用于凝胶电泳检测，不需要额外添加任何核酸染料。试剂盒中的 Super EvaGreen 可以作为 DNA 预染的核酸染料，电泳后可以直接用于观察 DNA 条带。
使用方法
一. 实验 参考因素
1. qPCR 仪器：对于 iCycler 的用户，不需要在 PCR Mix 里面额外添加 FAM。由于 EvaGreen ® 有轻微的背景荧光，它可以作为充足且稳定的校准基线来使用。对于 Roche Light Cycler 的用户，如果使用玻璃毛细管进行反应，那么需要在反应体系中额外加入 BSA（终浓度 ～0.5 mg/mL）；如果使用透明的塑料毛细管，则不需要添加 BSA。
2. 溶解曲线分析仪器：Rotor-Gene 6000, ABI 7500 FAST,HR1™, 384-well LightScanner™, Roche LightCycler 480,Rotor-Gene 6000, ABI 7500 FAST 和 Roche LightCycler 480等仪器都可以用于 qPCR 和溶解曲线的分析。具体参照仪器生产商的使用说明进行数据的采集和分析操作。
3. ΔR 和 ΔR N ：当比较众多 qPCR Master Mix 产生的荧光信号强度时，需要注意比较的方法。通常 ΔR 是高于基线水平的荧光增量。一般来说，10 μL 的 1×Fast Super EvaGreen ®反应体系与 50 μL ABI 公司的 1×PowerSYBR 或 Invitrogen公司的 1×SYBR Green I 相比，可以产生更高的 ΔR。ΔR N定义为 ΔR 除以 ROX 值。因此高浓度的 ROX 可以产生更低的 ΔR N 。当 ROX 被 ABI 7500, iCycler IQ, MJ opticon, MJ Chromo4, MX3000 或 MX4000 仪器最大激发时，ΔR N 会更小。因此，应用于商业 SYBR Green Master Mix 的较低浓度的 ROX 往往会产生更高的 ΔR N 。
4. 预期的动力学曲线：根据对比实验我们发现，Fast SuperEvaGreen ® Master Mix 的 PCR 扩增曲线与 SYBR Green I 的Master Mix 相比，其灵敏度和稳定性更高。由于 SYBR 染料对 DNA 扩增的抑制性影响，基于 SYBR 染料的 MasterMix 在 PCR 达到 Ct 阈值后通常会延迟扩增 5-7 个循环数。相比较而言，Fast Super EvaGreen ® Master Mix 可以使 PCR持续扩增至 50 个循环。
5. Ct 值：在相同 PCR 反应条件下，使用 Super EvaGreen ®和 SYBR Green I 进行的 qPCR 反应，其 Ct 值相对误差在+1或-1 之间。
6. 扩增片段长度：为了使 Super EvaGreen ® Master Mix 的扩增效率达到最佳，推荐的 DNA 扩增长度为 50-200 bp，如果需要扩增更长的 DNA 片段，那么需要适当延长 PCR 的反应时间。
7. 凝胶电泳分析 PCR 扩增产物：当使用 Super EvaGreen ®Master Mix 进行 PCR 扩增反应后，如需进行 DNA 凝胶电泳分析，只要在 PCR 反应溶液中加入 DNA loading buffer，按常规程序上样，跑电泳，不需要在制胶时额外添加核酸染料。使用 254 nm UV 激发器、凝胶成像仪，或 SYBR Green 滤光器可以直接观察凝胶。 另外，凝胶也可以用 488nm 的激光凝胶扫描仪进行观察。
二、PCR 反应体系
每管反应组分如下表所示：

1. cDNA 模板：Super EvaGreen ® Master Mix 适用于 mRNA的定量分析。第一步通过逆转录将 mRNA 转录成 cDNA，第二步利用 Super EvaGreen ® kit 进行 cDNA 的定量扩增。为了确保扩增效率，cDNA 样品的体积不要超过总反应体积的 10%。为了精确定量转录水平，我们推荐使用 no-RT 的对照样品，以排除可能的基因组 DNA 的污染。
2. 一步法 RT-qPCR 用于 mRNA 的定量分析。首先引物设计时要尽量避免形成引物二聚体。我们建议合理优化逆转录酶的使用量和逆转录过程的持续时间。耐热的逆转录酶可以兼容 Agilent, Fermentas, Lucigen 和 Life Technologies 等各种仪器。如果可以，设计的引物 Tm 值尽量在 55℃左右，逆转录及后续扩增反应也应在 55℃。为精确定量转录水平，我们推荐使用 no-RT 的对照样品，以排除有可能的基因组DNA 的污染。
3. 模板浓度：DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
4. 参照染料 ROX：对于某些固定型号的仪器，必须添加ROX 才能精确测定 Ct 值。 ROX 的使用浓度可以参照表 1（见第4页）。ROX会给熔解曲线分析造成一定的背景干扰。因此，为了避免 ROX 杂峰干扰，在应用软件的“ PassiveReference Dye”中不要选择检测 ROX 荧光值选项，然后再进行数据的收集与分析。

三、反应程序设置
您可以根据扩增模板的性质和仪器的功能，选择以下三个程序之一进行实验。
A ．两步快速扩增法
这个程序适用于大多数引物 Tm 为 60℃的扩增，溶解曲线遵循您所用仪器提供的标准流程执行。

注意事项

5.变性时间：如果扩增片段较短，变性时间可以低于 5 s，甚至可以低至 0 s。当变性时间设置为“0”时，它仅仅意味着温度增加到 96 ℃，然后没有停留迅速降温。设置时间 5 s可以确保 DNA 较长片段和高 GC 片段的变性。高性能的仪器会进一步增加扩增子变性的可靠性。

B . 三步扩增法
这个程序适用于扩增温度比退火温度高的实验。例如，如果扩增片段有相对较长的引物，容易产生非特异性的扩增，在更高的温度下进行延伸可以降低非特异性扩增。溶解曲线遵循您所用仪器提供的标准流程执行。

注意事项
6.退火温度：退火温度应根据引物 Tm 值设定，通常是 50-60 ℃为佳。不过，引物 Tm 值（和扩增温度）应该设计尽可能地接近 60 ℃（但仍在 50 – 60 ℃范围内），减少退火和变性温度之间的差距。这样温度增加所需时间更少，进而扩增效率更高。

7. 扩增温度：扩增温度设定在 72 ℃对于大多数扩增子通常效率更高。然而对于富含 AT 的扩增片段（> 70%）或含有AT 富集补丁的扩增子，60 ℃延长通常可以获得更好的结果。
C ．通用程序
此程序适用于几乎所有 qPCR 仪器，也适用于使用快速扩增法无法达到较好效果的扩增子。

Super EvaGreen 染料特性
光谱特性

图 1. 在 TE 缓冲液中，结合到双链 DNA 中的 Super EvaGreen 染料的激发光谱（左图）和发射光谱（右图）。
SYBR Green I 与 与 Super EvaGreen ® 荧光染料的稳定性比较

图 2. Super EvaGreen ® 、SYBR Green I 的吸收光谱 1.2uM, pH 9 的 Tris 缓冲液中，99℃孵育 3 小时后，两种荧光染料溶液的相对荧光强度，ROX 作参照物

Super EvaGreen ® 染料特性
染料的稳定性
Ames 实验显示，Super EvaGreen ® 染料没有细胞毒性和致突变性，该染料不具细胞膜渗透性（图 3），这是其低细胞毒性的一个关键因素。相反地，众所周知，SYBR Green I 荧光染料具有很强的致突变性，可能原因是其抑制了细胞内 DNA 修复机制（Ohta, etel. Mutat. Res.492, 91(2001)），而 SYBR Green I 较强的细胞毒性是由其较高的细胞膜渗透性所导致的（图 3）。
Super EvaGreen ® 、SYBR Green I 荧光染料细胞膜渗透性比较

图 3. 37℃条件下，用 SYBR Green I 或 Super EvaGreen ® （1.2uM）孵育 HeLa 细胞，分别在 5 min 或 30 min 后拍照，观察荧光强度。SYBR Green I 迅速渗透进入细胞，然而 Super EvaGreen ® 几乎不具有细胞膜渗透性。
表 1 、根据 PCR 仪种类不同，推荐 ROX 使用浓度