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Super ECL Prime （灵敏化学发光检测试剂盒）
Super ECL Prime 免疫印迹底物是用于增强型化学发光（ECL）的入门级过氧化物酶底物，性价比极高，可直接替代昂贵的产品而无需对实验条件进行任何优化。
- 描述
- 常见问题
- 参考文献
描述
产品名称：Super ECL Prime （灵敏化学发光检测试剂盒）
产品货号：S6008
产品内容及规格：100mL（A 液 50mL + B 液 50mL ），500mL（A 液 250mL + B 液 250mL）
储存 条件
4℃密封避光保存一年以上，短期可放置室温。
产品描述
Super ECL Prime 免疫印迹底物是用于增强型化学发光（ECL）的入门级过氧化物酶底物，性价比极高，可直接替代昂贵的产品而无需对实验条件进行任何优化。
Super ECL Prime 免疫印迹底物适用于辣根过氧化物酶（HRP）的检测，与其他标准增强型化学发光底物相比，性能同样可靠，但成本更低。由于该底物采用了与其它品牌的底物产品相同的鲁米诺和过氧化物酶配方，因此用户无需对检测条件或孵育方案进行任何优化，从而大大节约成本。
Super ECL Prime （灵敏）特点：
1. 简单易用；
2. 灵敏度更高：可检测低皮克级的蛋白；
3. 信号稳定：光信号可稳定 1-2 h；
4. 价格更经济：相比其他品牌的类似产品，不仅具有高品质和高性能，同时价格也更低。
使用方法
1. 执行常规 SDS-PAGE、转膜和 Western Blot 步骤，0.25-1μg/mL 一抗孵育 1 小时或过夜，洗膜后，0.1-0.2 μg/mL 二抗孵育 30-60 min。
2. Western Blot 最后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液：分别取等体积的溶液 A 和 B，放入干净容器中混合。
注：建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。
3. 用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液（0.125 mL 发光工作液/cm 膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育 3-5 min。
4. 取膜，弃发光工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行压片检测或成像仪检测。
5. 压片检测：将膜固定于片夹内，蛋白带面向上。暗室内压片 1 min，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 s、1、3、5 min，然后一起显影定影观察结果。
6. 成像仪检测：将膜放置到成像仪内，参考仪器说明书进行检测。
注意事项
1. 步骤 1～4 可在日光灯下操作，但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
2. 长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系，曝光不足则条带模糊。
3. 发光工作液孵育约 3 min 后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使 X 光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使 X 光胶片感光，因而弱带可曝光 1-10 h。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用 ECL 发光和曝光。
4. 由于发光液极其灵敏，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗 1:1000～1:4000，二抗 1:5000～1:10000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败。
5. 某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。
6. 使用肉眼可见的预染色蛋白 Marker 和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。
7. NaN 3 能抑制HRP 活性，回收第二抗体应避免使用NaN 3 ，如必需使用勿超过 0.01%。
| 问题 | 可能的原因 | 解决方案 |
| 反向图像（即白色条带黑色背景） | 体系中过多的 HRP | 进一步稀释 HRP 结合物 |
| 膜上有棕色或黄色条带 | 体系中过多的 HRP | 进一步稀释 HRP 结合物 |
| 在暗室污点发光 | 体系中过多的 HRP | 进一步稀释 HRP 结合物 |
| 信号持续时间少于 8 h | 体系中过多的 HRP | 进一步稀释 HRP 结合物 |
| 信号微弱或没有 | 体系中太多的 HRP 耗尽底物，导致信号很快消退 | 进一步稀释 HRP 结合物 |
| 信号微弱或没有 | 抗原或抗体量不足 | 增加抗原或抗体含量 |
| 信号微弱或没有 | 蛋白转膜效率过低 | 优化转膜 |
| 高背景 | 体系中过多的 HRP | 进一步稀释 HRP 结合物 |
| 高背景 | 封闭不够 | 优化封闭条件 |
| 高背景 | 封闭液不合适 | 尝试换另一种封闭液 |
| 高背景 | 洗膜不够 | 增加洗膜的时间、次数或洗膜液体积 |
| 高背景 | 过度曝光 | 降低曝光时间 |
| 高背景 | 抗原或抗体浓度过高 | 降低抗原或抗体浓度 |
| 蛋白条带内有斑点 | 蛋白转膜效率过低 | 优化转膜程序 |
| 蛋白条带内有斑点 | 水化膜不均 | 正确执行制造商的推荐水化膜过程 |
| 蛋白条带内有斑点 | 膜和膜之间存在气泡 | 曝光前去除气泡 |
1. CRC Handbook of Immunoblotting of Proteins: Volume 1 Technical Description. Eds Ole J. Bjerrum, Ph.D., M.D. and Niels H.H.
Heegaard, M.D. CRC Press, Inc.: Boca Raton, FL, 1988.
2. Kaufmann, S.H., et al. (1987). The erasable Western blot. Anal Biochem 161:89-95.
3. Mattson, D.L. and Bellehumeur, T.G. (1996). Comparison of three chemiluminescent horseradish peroxidase substrates for
immunoblotting. Anal Biochem 240:306-308.
4. Walker, G.R., et al. (1995). SuperSignal CL-HRP: A new enhanced chemiluminescent substrate for the development of the
horseradish peroxide label in Western blotting applications. J of NIH Research 7:76.
