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Super EvaGreen ® , 20×
Super EvaGreen ® 是一种用于实时定量 PCR（qPCR）的 DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于 SYBR Green I。
- 描述
描述
产品名称：Super EvaGreen ® , 20× 水溶液
产品货号：S2007
产品规格：1 mL，5mL
应用范围：实时定量 PCR、高分辨率溶解曲线
产品参数
λabs/λem = 500/530 nm (结合 DNA)
λabs = 471 nm (未结合 DNA)
储存条件
4℃或-20℃，避光保存，有效期 1 年。
产品 介绍
Super EvaGreen ® 是一种用于实时定量 PCR（qPCR）的 DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于 SYBRGreen I。除了有相似的光谱特性，Super EvaGreen 有三个主要特点使它区别于 SYBR Green I 。
首先，Super EvaGreen ® 对 PCR 的抑制性远小于 SYBR Green I。因此，使用 Super EvaGreen ® 进行的 qPCR 实验可以使用快速 PCR 步骤。同时，Super EvaGreen ® 在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于 SYBR Green I 扩增信号。较高浓度的 Super EvaGreen ® 也消除了“染料重分布”的缺陷，使 Super EvaGreen ® 既可用于多重 PCR，也可用于高分辨率（高清晰）溶解曲线分析（HRM）。该分析正被越来越多的用于PCR 后的基因分型和异源双链分析。由于 SYBR Green I 对 PCR 的抑制性，从而要求其使用浓度必须很低，因此 SYBR Green I 无法解决由低浓度造成的染料重分布问题，既不能用于多重 PCR 也不能用于 HRM。同时，染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性，因为低熔点的DNA 链可能由于这种原因而无法检测到。
第二，Super EvaGreen ® 的稳定性极强。在正常的储存、操作和 PCR 过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBR Green I 不稳定而且降解后对 PCR 抑制性更强。
第三，Super EvaGreen ® 降低了细胞膜透性，因而比SYBR Green 1 更加安全。独立实验室的测试结果显示，Super EvaGreen ® 既没有诱变性也没有细胞毒性。相反，虽然 SYBRGreen I 本身诱变性很弱，但它在细胞中可能抑制了正常DNA 的修复机制，使其有诱变增强作用。考虑到 PCR 的广泛使用，其安全性应该足够重视。
使用方法
1. 如下建立实验体系：（仅供参考）
| 名 称 | 体 积 |
| 10× 的无镁离子聚合酶缓冲液 | 5 µL |
| 50 mM MgCl 2 | 2.5 µL |
| 2 mM dNTP | 5 µL |
| 20×Super EvaGreen ® | 2.5 µL |
| Taq DNA polymerase | 1-5 units |
| F, R Primers | 各 0.1-0.5 µM |
| 模板 | 适量 |
| dH 2 O | to a final volume of 50 µL |
主要试剂
实时定量 PCR 检测 20× Super EvaGreen ®实验目的
注：DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类
的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行
梯度稀释，确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA 作为模板
时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
2. 执行实时定量 PCR 程序，采集荧光信号。
1. Prime
hβ-actin：
forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)
3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)
4. BSA: Sigma(A7030)
5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)
实验方案
1. 配制 2× Super EvaGreen ® Buffer
2×Super EvaGreen ® Buffer | ||
组分 | 浓度 | 体积（μL） |
1 M Tris HCl pH8.5 | 50 mM | 5 |
500 mM (NH4) 2 SO 4 | 20 mM | 4 |
| 50 mM MgCl 2 | 7 mM | 14 |
50% glycerol | 2.5% | 5 |
| DMSO | 10 % | 10 |
20× Super EvaGreen ® Buffer | 2× | 10 |
| 10 mM dNTPs | 0.4 mM | 4 |
2 % Tween20 | 0.03 % | 1.5 |
1 mg/mL BSA | 22 | 2.2 |
H 2 O | 44.3 | |
Total volume | 100 | |
2. 配制 q-PCR 反应体系
| 成分 | 20 μL/ 体系/ 管反应 |
| 10 μM primers | 1μL |
| 模板 | 适量 |
| HS Taq DNA 酶 （5 U/μL） | 0.2 μL |
| 2× Super EvaGreen ® buffer | 10 μL |
| H 2 O | 定容至 20 μL |
注：a. DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA 作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
b. 引物终浓度一般控制在 0.1-0.5μM 范围内。
3. 实验分组：标准对照样品孔（阳性对照）、检测样品孔、空白对照孔（阴性对照）共三组，同时进行检测，分别进行三次平行实验。
4. 混匀离心、上机进行荧光定量 PCR（仪器为 Roche：LC96）。
PCR 程序：
| 温度 | 时间 |
| 95 ℃ | 2 min |
| 95 ℃ | 5 sec |
| 60 ℃ | 30 sec |
| 重复 2~3，共 45 个循环 | |
| 溶解曲线 57 ℃~99 ℃ | |
5. 保存数据，判断样本质量：
A．检测样品与标准品之间的 Ct 值差
B．检测样品与标准品之间的荧光强度差
检测结果需达到：以上两组检测指标无显著性差异。
